Filtros para microscopía de fluorescencia láser

Debido a su alto brillo, estabilidad, larga vida útil y ancho de banda espectral estrecho, los láseres están reemplazando gradualmente las fuentes de luz tradicionales de banda ancha en aplicaciones de imágenes de fluorescencia. En aplicaciones de imagen, las características anteriores del láser pueden mejorar la sensibilidad de la visualización y aumentar el flujo de luz; El láser también tiene propiedades únicas, como ángulos estrechos de emisión de haz, alta coherencia temporal y espacial y características claras de polarización, que han inspirado muchas nuevas técnicas de imágenes de fluorescencia. Sin embargo, en comparación con las fuentes de luz de banda ancha, cuando el láser aparece en forma de fuente de fluorescencia, se presentan nuevos requisitos y limitaciones para los sistemas de imagen basados en láser y sus componentes, especialmente para las películas de filtro óptico.

Filtros ópticos optimizados para fuentes láser

En las últimas cuatro décadas, se han desarrollado muchos láseres de alta potencia, alta eficiencia y bajo costo. Las personas generalmente clasifican los láseres según el medio de ganancia y el modo de excitación. Hasta la fecha, los láseres más utilizados para la proyección de imágenes de fluorescencia siguen siendo los láseres de gas (como los láseres de iones de níquel y níquel), con las líneas espectrales más utilizadas en 488, 568 y 647 nm. Sin embargo, en los últimos años, los láseres de estado sólido están reemplazando gradualmente los láseres de gas debido a su mayor eficiencia (menos calor, instalación de laboratorio más fácil) y menor costo. Los tipos comunes de láser incluyen láseres de diodo semiconductor (especialmente 405 y 635 nm), láseres de semiconductor de bombas ópticas (incluidos los ampliamente utilizados 488 nm) y láseres de estado sólido de bombas de diodo doble frecuencia (DPSS) (incluidos los láseres amarillos de 561 nm y los más nuevos láseres de 515 nm y 594 nm).

Aplicación de la membrana de filtro óptico en la microscopía de fluorescencia láser

Dado que el divisor de haces está expuesto directamente a la luz de fuerte excitación, incluso la débil fluorescencia espontánea del filtro puede interferir con la señal de la luz emitida. Por lo tanto, se deben utilizar sustratos fluorescentes ultra bajos como el cuarzo fundido. Tenga en cuenta que debido a la diferencia de intensidad entre la luz de excitación y la señal de emisión, los requisitos para la propia fluorescencia del filtro de emisión no serán tan estrictos como para los separadores de color. Sin embargo, en el microscopio, la intensidad del filtro de emisión es significativamente mayor que la de un filtro de microscopio de gran angular de fluorescencia típico, ya que el haz láser en el sistema se reflejará por completo desde el vidrio portador de la muestra y cambiará de dirección a lo largo de la trayectoria de emisión. Por lo tanto, la fluorescencia espontánea del filtro de emisión en este sistema láser debe considerarse cuidadosamente en comparación con la fluorescencia espontánea en un sistema de banda ancha.

En algunas aplicaciones, el divisor de haces puede tener un impacto significativo en la calidad de la imagen, especialmente cuando el divisor de colores no es plano (curvatura). Incluso si la curvatura de la matriz no se ve afectada por el error de onda frontal, el error de onda frontal reflectante puede tener un impacto significativo en la calidad de imagen. Por ejemplo, la iluminación de la muestra en el microscopio puede ser débil cuando un divisor de haz con baja planitud se coloca en el camino de excitación. Del mismo modo, debido a la tensión de flexión inherente del recubrimiento duro, puede causar una desviación de la imagen del haz de imagen reflejado por el separador de color. Por lo tanto, algunas aplicaciones deben usar separadores de color de alto nivel. Para la mayoría de los microscopios láser, el divisor de haz debe ser lo suficientemente plano como para que el foco del haz láser irradiado no se mueva significativamente, donde el movimiento del foco generalmente se define por el rango de Rayleigh. En pocas palabras, el criterio de elegibilidad para el haz de imagen reflejado por el separador de color es que el tamaño del punto de difracción no debe cambiar significativamente después de ser reflejado en el separador de color.

Los sistemas de imagen microscópica basados en láser son estructuralmente complejos y costosos. En el proceso de obtener el máximo rendimiento, el papel de la película de filtro óptico es muy importante. Es aún más importante seleccionar correctamente la película de filtro óptico que coincida con su rendimiento. ¿Cuál es el futuro de los sistemas de imágenes basados en láser? Para observar mejor los mecanismos de interacción entre las células o estructuras subcelulares, han surgido muchos esquemas de imagen complejos. Las películas filtrantes de alta eficiencia desempeñan un papel cada vez más importante en estas aplicaciones de vanguardia.